01

Introduction

生物反應(yīng)器是用于微生物和細(xì)胞的體外培養(yǎng)，并通過生化反應(yīng)或發(fā)酵過程獲取產(chǎn)物的裝置，是生物合成、生物發(fā)酵、生物制藥領(lǐng)域中關(guān)鍵的設(shè)備之一。而平行生物反應(yīng)器可同一系統(tǒng)控制多個單元，使其保持各項參數(shù)的高度一致性，是合成生物學(xué)產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)工藝設(shè)計方案重要的環(huán)節(jié)，其核心功能是高通量篩選（high-throughput screening）和工藝放大。

02

Application

Background

藻藍(lán)素（Phycocyanobilin，PCB）天然存在于藍(lán)藻光感應(yīng)系統(tǒng)中，在光能的吸收和傳遞中起著至關(guān)重要的作用，在光遺傳學(xué)的研究中被廣泛應(yīng)用。由于其具有亮麗的天藍(lán)色，可以作為天然色素在食品飲料中呈色，安全健康，營養(yǎng)豐富，是FDA唯一批準(zhǔn)的藍(lán)色食品添加劑。PCB還具有抗氧化、消除自由基、修復(fù)細(xì)胞延緩衰老、保水抗凍的作用，廣泛應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域。此外，作為一種安全的藥物，口服PCB在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為NADPH氧化酶的有效抑制劑，在治療阿爾茨海默癥方面表現(xiàn)出巨大潛力；PCB對冠狀病毒主要蛋白酶的活性也具有潛在的抑制作用，有潛力應(yīng)用于防治近年來爆發(fā)的新型冠狀肺炎病毒。目前，PCB的獲取方法主要采用高溫甲醇分解法從螺旋藻中提取。該方法存在諸多問題：（1） 甲醇高溫?zé)峤庑枰馁M大量的能量，造成能源浪費；（2） 螺旋藻中與PCB共存的其他色素，如葉綠素、葉黃素等一系列前體，對后期產(chǎn)物純化有不利影響；（3）螺旋藻生長周期較長，限制了藻藍(lán)素的生產(chǎn)效率和應(yīng)用。因此，從天然藻類中提取高純度的PCB是一項復(fù)雜且不經(jīng)濟(jì)的方法，而采用合成生物學(xué)的方法合成PCB具有降低成本、節(jié)約能源和提高純度的優(yōu)點，目前已有研究人員在5 L發(fā)酵罐實現(xiàn)了PCB世界最高水平合成。

Strategy

首先，通過比較選擇了來源于T. elongatus的HO1和來源于Synechocystis sp的PcyA來合成PCB，在此基礎(chǔ)上，確定了含有強(qiáng)誘導(dǎo)啟動子(T7lac)的高拷貝數(shù)質(zhì)粒(pRSFDuet-1)最適合表達(dá)這兩種酶(圖1，圖2)。

▲圖1 用于PCB合成的模塊。灰色區(qū)域包括參與ALA替代途徑（C4或C5途徑）的酶合成；紅色區(qū)域包括參與血紅素合成的酶和中間體；藍(lán)色區(qū)域包括參與PCB合成的酶和輔酶因子。

Figure 1. Modules for PCB synthesis. The gray block includes the enzymes involved in the alternative pathways (C4 or C5 pathway) for ALA synthesis; the red block includes enzymes and intermediates involved in heme synthesis; the blue block includes enzymes and cofactors involved in PCB synthesis.

▲圖2優(yōu)化HO和PcyA的表達(dá)策略以合成藻藍(lán)素。（a）從不同來源選擇HO和PcyA；（b）HO1和PcyA表達(dá)的質(zhì)粒和啟動子的優(yōu)化。藍(lán)色和深灰色條表示PCB和分別為OD600。

Figure 2. Optimize the expression strategy of HO and PcyA to synthesize phycocyanin. (a) Selection of HO and PcyA from different sources; (b) optimization of plasmids and promoters for HO1 and PcyA expression. The blue and dark-gray bars represent the concentrations of PCB and OD600, respectively.

此外，在中等拷貝數(shù)的pCDFDuet-1載體中，采用DNA支架以2:1的比例實現(xiàn)HO1和PcyA的有效組裝(圖3)。

▲圖3通過DNA支架調(diào)節(jié)HO和PcyA比例促進(jìn)藻藍(lán)素合成

Figure 3. Regulation of HO and PcyA ratio by the DNA scaffold to improve PCB synthesis.

隨后，通過直接補(bǔ)充血紅素前體ALA和適度過表達(dá)血紅素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶(HemB和HemH)，增加細(xì)胞內(nèi)前體物質(zhì)供應(yīng)，促進(jìn)PCB合成。由于催化血紅素合成PCB的兩步酶促反應(yīng)都伴隨著鐵氧還蛋白（Fd）和Fd-NADP+還原酶（Fnr）的循環(huán)再生，研究人員通過表達(dá)nadK基因（編碼NAD+激酶）來加速輔因子循環(huán)，進(jìn)一步增強(qiáng)了PCB合成（圖4）。

▲圖4 PCB合成中的輔因子增強(qiáng)循環(huán)

Figure 4. Enhanced cycle of cofactors for PCB synthesis.

此外，研究人員還通過添加還原劑作為輔助，發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中加入維生素C或谷胱甘肽時，藻藍(lán)素產(chǎn)量會得到提高，進(jìn)一步優(yōu)化了維生素C的添加量，發(fā)現(xiàn)添加5 g/L維生素C時，最適合PCB生產(chǎn)。

最后，分別在搖瓶和發(fā)酵罐水平對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化（圖5）。

▲圖5在5L發(fā)酵罐中放大分批和補(bǔ)料分批發(fā)酵。（a）分批發(fā)酵；（b）600g補(bǔ)料分批發(fā)酵/L葡萄糖和8g/L MgSO4·7H₂O；（c）通過添加600 g/L葡萄糖、8 g/L MgSO₄·7H₂O和200 mg/L FeSO₄·7H₂O進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵；（d）通過添加600 g/L葡萄糖、8 g/L MgSO₄·7H₂O、200 mg/L FeSO₄·7H₂O和5 g/L(NH₄)₂SO₄進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵

Figure 5. Scale-up batch and fed-batch fermentation in a 5 L fermenter. (a) Batch fermentation; (b) fed-batch fermentation by feeding with 600 g/L glucose and 8 g/L MgSO₄·7H₂O; (c) fed-batch fermentation by feeding with 600 g/L glucose, 8 g/L MgSO₄·7H₂O, and 200 mg/L of FeSO₄·7H₂O; (d) fed-batch fermentation by feeding with 600 g/L glucose, 8 g/L MgSO₄·7H₂O, 200 mg/L of FeSO₄·7H₂O, and 5 g/L (NH₄)₂SO₄

在搖瓶水平，在30℃條件下用0.8 mM IPTG誘導(dǎo)，采用含有200mg/L ALA、20 mg/L FeSO4·7H?O和5 g/L維生素C的MR培養(yǎng)基有利于提高PCB的產(chǎn)量。在發(fā)酵罐水平，采用pH-stat法進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，添加600g/L葡萄糖、8g/L MgSO4·7H?O和200 mg/L FeSO4·7H?O，在發(fā)酵罐水平獲得藻藍(lán)素28.32 mg/L，是至今報道的最高產(chǎn)量。此研究為在大腸桿菌中合成藻藍(lán)素或血紅素衍生物及其他天然色素提供了策略。

03

Conclusion

提取耗能大、純化復(fù)雜且原料獲取周期長的藻藍(lán)素通過生物合成的方法實現(xiàn)了目前發(fā)酵最高的產(chǎn)量，以大腸桿菌為工程菌成功構(gòu)建PCB完整代謝通路，通過基因調(diào)控手段（過表達(dá)關(guān)鍵酶及相關(guān)酶上游基因等）和輔料添加來促進(jìn)PCB的合成，再于生物反應(yīng)器內(nèi)對菌種進(jìn)行放大培養(yǎng)并對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，采取補(bǔ)料分批發(fā)酵的方法在5 L發(fā)酵罐水平獲得了PCB的高產(chǎn)量合成。

合成生物學(xué)是從原料到菌種再到產(chǎn)品的全鏈條設(shè)計和優(yōu)化，可以在改造和優(yōu)化天然表達(dá)體系的同時，將動物源和植物源的代謝路徑構(gòu)建到微生物體系中，重新合成全新的人工生物體系，最終實現(xiàn)目標(biāo)代謝物的異源表達(dá)，將原料以較高的速率最大限度地轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。而平行生物反應(yīng)器是合成生物學(xué)產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)工藝設(shè)計方案重要的環(huán)節(jié)，其核心功能是高通量篩選和工藝放大，研究目標(biāo)菌種在較大培養(yǎng)體系下的生長行為，優(yōu)化生長pH、補(bǔ)料速度、攪拌速度、誘導(dǎo)劑添加、通氣量等培養(yǎng)條件，實時監(jiān)測體系內(nèi)溶氧、溫度等生長參數(shù)，多個反應(yīng)器同時控制，使發(fā)酵過程一致，發(fā)酵結(jié)果具有一致性與平行性。“新芝·主元”MPB平行生物反應(yīng)器，針對不同培養(yǎng)需求設(shè)計開發(fā)了500 mL、1000 mL和2400 mL三款不同容積的發(fā)酵設(shè)備，單元模塊數(shù)量可按需拓展，適用于菌種的發(fā)酵工藝優(yōu)化、工藝固定的菌種高通量篩選、最適培養(yǎng)基篩選等方向，涉及基因工程、生物制藥、酶工程、合成測序、代謝途徑/ 網(wǎng)路及生物底盤的設(shè)計與改造等多個領(lǐng)域。平行生物反應(yīng)器上下游行業(yè)廣泛，是研究合成生物學(xué)的得力助手，如有興趣，期待您的咨詢。

圖源：DOI: 10.1021/acssynbio.2c00016