1、點(diǎn)擊“準(zhǔn)備酶切目的DNA” ----桌面右側(cè)出現(xiàn)DNA， 10×Buffer，限制性內(nèi)切酶， ddH₂0，左側(cè):實(shí)驗(yàn)儀器：振蕩器，恒溫槽，EP管。

   實(shí)驗(yàn)提示：準(zhǔn)備EP管

 

2、準(zhǔn)備EP管 ----點(diǎn)擊EP管，并拖動至工作臺中央（EP管外顯示刻度0.5ml，1.0ml，鼠標(biāo)置于EP管上，說明框內(nèi)顯示“1.5mlEP管”，3秒鐘后隱去）；

      實(shí)驗(yàn)提示：準(zhǔn)備加入目的DNA

 

3、加入RT-PCR產(chǎn)物（目的DNA）---- 1 點(diǎn)擊微量吸液器（說明框顯示“吸取15ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點(diǎn)擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“20ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點(diǎn)擊微量吸液器，拖動至盛有RT-PCR產(chǎn)物處，點(diǎn)擊RT-PCR產(chǎn)物（槍頭內(nèi)顯示吸取15ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，點(diǎn)擊微量吸液器（出現(xiàn)槍頭內(nèi)液體注入EP管內(nèi)的畫面），液體注入后，EP管蓋子蓋上，微量吸液器回到原位置。

實(shí)驗(yàn)提示：下一步選擇兩種限制性內(nèi)切酶。

 

    4、選擇限制性內(nèi)切酶---- 1點(diǎn)擊限制性內(nèi)切酶，出現(xiàn)對話框，出現(xiàn)RT-PCR產(chǎn)物序列：AACGAATTCACAATGGTCAGATCATCTTCT…

及備選擇的5種內(nèi)切酶及各自切割位：SCA I:AGTACT ,

BamH I:GGATCC,

PVU Ⅰ:CGATCG,

ECOR I:GAATTC,

PVU Ⅱ:CAGCTG,

XMN I: GAANNN TTC。

各個酶前面有一個選擇框，點(diǎn)擊即為選擇用。選擇“BamH I”和“ECOR I”提示“選擇正確”，對話框消失，如選擇其他組合提示“選擇錯誤，請重新選擇”。

    實(shí)驗(yàn)提示：加入選中的限制性內(nèi)切酶

 

5、加入限制性內(nèi)切酶----  1 點(diǎn)擊微量吸液器（說明框顯示“吸取0.25ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點(diǎn)擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“1ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點(diǎn)擊微量吸液器，拖動至盛有BamH I處，點(diǎn)擊（槍頭內(nèi)顯示吸取0.25ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，點(diǎn)擊微量吸液器（出現(xiàn)槍頭內(nèi)液體注入EP管內(nèi)的畫面），液體注入后，微量吸液器回到原位置。⑤點(diǎn)擊微量吸液器，拖動至盛有ECOR I處，點(diǎn)擊（槍頭內(nèi)顯示吸取0.25ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，點(diǎn)擊微量吸液器（出現(xiàn)槍頭內(nèi)液體注入EP管內(nèi)的畫面），液體注入后EP管蓋子蓋上，微量吸液器回到原位置。

     實(shí)驗(yàn)提示: 加入10×Buffer

 

6、加入10×Buffer ----點(diǎn)擊微量吸液器（說明框顯示“吸取2ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點(diǎn)擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“5ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點(diǎn)擊微量吸液器，拖動至10×Buffer處，點(diǎn)擊10×Buffer（槍頭內(nèi)顯示吸取2ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，EP管蓋子打開，點(diǎn)擊微量吸液器（出現(xiàn)槍頭內(nèi)液體注入EP管內(nèi)的畫面），液體注入后，EP管蓋子蓋上，微量吸液器槍頭自動至垃圾桶，微量吸液器回到原位置。

實(shí)驗(yàn)提示：加入ddH₂O

 

7、加入ddH₂O ----①點(diǎn)擊微量吸液器（說明框顯示“吸取2.5ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點(diǎn)擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“5ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點(diǎn)擊微量吸液器，拖動至ddH₂O處，點(diǎn)擊ddH₂O（槍頭內(nèi)顯示吸取2ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，EP管蓋子打開，點(diǎn)擊微量吸液器（出現(xiàn)槍頭內(nèi)液體注入EP管內(nèi)的畫面），液體注入后，EP管蓋子蓋上，微量吸液器槍頭自動至垃圾桶，微量吸液器回到原位置。

實(shí)驗(yàn)提示：振蕩混勻

 

8、振蕩---- 1點(diǎn)擊振蕩器，振蕩器出現(xiàn)在工作臺中央。②移動加完樣的EP管至振蕩器上方，③點(diǎn)擊“開始振蕩”，EP管開始在振蕩器上方旋轉(zhuǎn)振蕩，④點(diǎn)擊“停止”，即停止振蕩，振蕩器消失，EP管出現(xiàn)在工作臺中央。

     實(shí)驗(yàn)提示：限制酶酶切

 

    9、酶切---- 1點(diǎn)擊恒溫槽，恒溫槽出現(xiàn)在工作臺中央；3移動振蕩后的EP管至恒溫槽內(nèi)，③出現(xiàn)選擇恒溫槽溫度對話框，“1：16℃”，“2：37℃”，“3：42℃”，選擇“37℃”則提示“選擇正確”，對話框消失，如選擇其他則提示“選擇錯誤，請重新選擇”④點(diǎn)擊“開始酶切”，則出現(xiàn)酶切畫面，并出現(xiàn)定時器，時間快速轉(zhuǎn)動，至提示4小時后酶切結(jié)束。畫面顯示有粘性末端的DNA形成，3秒鐘后隱去。

      實(shí)驗(yàn)提示：準(zhǔn)備酶切載體DNA

 

1、點(diǎn)擊“準(zhǔn)備酶切載體DNA（質(zhì)粒DNA）” ----桌面右側(cè)出現(xiàn)載體DNA， 10×Buffer，限制性內(nèi)切酶，堿性磷酸酶，ddH₂0，左側(cè):實(shí)驗(yàn)儀器：振蕩器，恒溫槽，EP管。

   實(shí)驗(yàn)提示：準(zhǔn)備EP管

 

2、準(zhǔn)備EP管 ----點(diǎn)擊EP管，并拖動至工作臺中央（EP管外顯示刻度0.5ml，1.0ml，鼠標(biāo)置于EP管上，說明框內(nèi)顯示“1.5mlEP管”，3秒鐘后隱去）；

      實(shí)驗(yàn)提示：準(zhǔn)備加入質(zhì)粒DNA

 

3、加入質(zhì)粒DNA---- 1 點(diǎn)擊微量吸液器（說明框顯示“吸取15ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點(diǎn)擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“20ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點(diǎn)擊微量吸液器，拖動至盛有載體DNA處，點(diǎn)擊載體DNA（槍頭內(nèi)顯示吸取15ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，點(diǎn)擊微量吸液器（出現(xiàn)槍頭內(nèi)液體注入EP管內(nèi)的畫面），液體注入后，EP管蓋子蓋上，微量吸液器回到原位置。

實(shí)驗(yàn)提示：下一步選擇兩種限制性內(nèi)切酶

 

     4、選擇限制性內(nèi)切酶---- 1點(diǎn)擊限制性內(nèi)切酶，出現(xiàn)對話框，出現(xiàn)RT-PCR產(chǎn)物序列：AACGAATTCACAATGGTCAGATCATCTTCT…

及備選擇的5種內(nèi)切酶及各自切割位：SCA I:AGTACT ,

BamH I:GGATCC,

PVU Ⅰ:CGATCG,

ECOR I:GAATTC,

PVU Ⅱ:CAGCTG,

XMN I: GAANNN TTC。

各個酶前面有一個選擇框，點(diǎn)擊即為選擇用。選擇“BamH I”和“ECOR I”提示“選擇正確”，對話框消失，如選擇其他組合提示“選擇錯誤，請重新選擇”。

     實(shí)驗(yàn)提示：加入選中的限制性內(nèi)切酶

 

5、加入限制性內(nèi)切酶----  1 點(diǎn)擊微量吸液器（說明框顯示“吸取0.25ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點(diǎn)擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“1ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點(diǎn)擊微量吸液器，拖動至盛有BamH I處，點(diǎn)擊（槍頭內(nèi)顯示吸取0.25ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，點(diǎn)擊微量吸液器（出現(xiàn)槍頭內(nèi)液體注入EP管內(nèi)的畫面），液體注入后，微量吸液器回到原位置。⑤點(diǎn)擊微量吸液器，拖動至盛有ECOR I處，點(diǎn)擊（槍頭內(nèi)顯示吸取0.25ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，點(diǎn)擊微量吸液器（出現(xiàn)槍頭內(nèi)液體注入EP管內(nèi)的畫面），液體注入后EP管蓋子蓋上，微量吸液器回到原位置。

     實(shí)驗(yàn)提示: 加入10×Buffer

 

6、加入10×Buffer ----點(diǎn)擊微量吸液器（說明框顯示“吸取2ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點(diǎn)擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“5ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點(diǎn)擊微量吸液器，拖動至10×Buffer處，點(diǎn)擊10×Buffer（槍頭內(nèi)顯示吸取2ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，EP管蓋子打開，點(diǎn)擊微量吸液器（出現(xiàn)槍頭內(nèi)液體注入EP管內(nèi)的畫面），液體注入后，EP管蓋子蓋上，微量吸液器槍頭自動至垃圾桶，微量吸液器回到原位置。

實(shí)驗(yàn)提示：加入ddH₂O

 

7、加入ddH₂O ----點(diǎn)擊微量吸液器（說明框顯示“吸取2.5ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點(diǎn)擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“5ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點(diǎn)擊微量吸液器，拖動至ddH₂O處，點(diǎn)擊ddH₂O（槍頭內(nèi)顯示吸取2ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，EP管蓋子打開，點(diǎn)擊微量吸液器（出現(xiàn)槍頭內(nèi)液體注入EP管內(nèi)的畫面），液體注入后，EP管蓋子蓋上，微量吸液器槍頭自動至垃圾桶，微量吸液器回到原位置。

實(shí)驗(yàn)提示：振蕩

 

8、振蕩---- 1點(diǎn)擊振蕩器，振蕩器出現(xiàn)在工作臺中央。②移動加完樣的EP管至振蕩器上方，③點(diǎn)擊“開始振蕩”，EP管開始在振蕩器上方旋轉(zhuǎn)振蕩，④點(diǎn)擊“停止”，即停止振蕩，振蕩器消失，EP管出現(xiàn)在工作臺中央。

     實(shí)驗(yàn)提示：酶切質(zhì)粒DNA

 

     9、酶切---- 1點(diǎn)擊恒溫槽，恒溫槽出現(xiàn)在工作臺中央；3移動振蕩后的EP管至恒溫槽內(nèi)，③出現(xiàn)選擇恒溫槽溫度對話框，“1：16℃”，“2：37℃”，“3：42℃”，選擇“37℃”則提示“選擇正確”，對話框消失，如選擇其他則提示“選擇錯誤，請重新選擇”④點(diǎn)擊“開始酶切”，則出現(xiàn)酶切畫面，并出現(xiàn)定時器，時間快速轉(zhuǎn)動，至提示4小時后酶切結(jié)束。

      實(shí)驗(yàn)提示：加入堿性磷酸酶

 

10、加入堿性磷酸酶----點(diǎn)擊微量吸液器（說明框顯示“吸取2.5ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點(diǎn)擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“5ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點(diǎn)擊微量吸液器，拖動至堿性磷酸酶處，點(diǎn)擊堿性磷酸酶（槍頭內(nèi)顯示吸取2ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，EP管蓋子打開，點(diǎn)擊微量吸液器（出現(xiàn)槍頭內(nèi)液體注入EP管內(nèi)的畫面），液體注入后，EP管蓋子蓋上，微量吸液器槍頭自動至垃圾桶，微量吸液器回到原位置。

      實(shí)驗(yàn)提示：振蕩混勻

 

11、振蕩---- 1點(diǎn)擊振蕩器，振蕩器出現(xiàn)在工作臺中央。②移動加完樣的EP管至振蕩器上方，③點(diǎn)擊“開始振蕩”，EP管開始在振蕩器上方旋轉(zhuǎn)振蕩，④點(diǎn)擊“停止”，即停止振蕩，振蕩器消失，EP管出現(xiàn)在工作臺中央。

     實(shí)驗(yàn)提示：堿性磷酸酶切除質(zhì)粒DNA5’-末端的磷酸基團(tuán)

 

     12、酶切---- 1點(diǎn)擊恒溫槽，恒溫槽出現(xiàn)在工作臺中央；3移動振蕩后的EP管至恒溫槽內(nèi)，③出現(xiàn)選擇恒溫槽溫度對話框，“1：16℃”，“2：37℃”，“3：42℃”，選擇“37℃”則提示“選擇正確”，對話框消失，如選擇其他則提示“選擇錯誤，請重新選擇”④點(diǎn)擊“開始酶切”，則出現(xiàn)酶切畫面，并出現(xiàn)定時器，時間快速轉(zhuǎn)動，至提示4小時后酶切結(jié)束。畫面顯示有粘性末端的載體DNA形成“半環(huán)狀”，3秒鐘后隱去。

         實(shí)驗(yàn)提示：連接反應(yīng)

 

1、點(diǎn)擊“開始連接反應(yīng)” ----桌面右側(cè)出現(xiàn)有粘性末端的DNA，有粘性末端的載體DNA，10×DNA連接Buffer，DNA連接酶，ddH₂0，左側(cè):實(shí)驗(yàn)儀器：振蕩器，恒溫槽，EP管。

實(shí)驗(yàn)提示：準(zhǔn)備EP管

 

2、準(zhǔn)備EP管----點(diǎn)擊EP管，并拖動至工作臺中央（EP管外顯示刻度0.5ml，1.0ml，鼠標(biāo)置于EP管上，說明框內(nèi)顯示“1.5mlEP管”，3秒鐘后隱去）；

    實(shí)驗(yàn)提示：加入酶切后目的DNA

 

3、加入酶切后的目的DNA---- 1 點(diǎn)擊微量吸液器（說明框顯示“吸取10ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點(diǎn)擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“20ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點(diǎn)擊微量吸液器，拖動至盛有酶切后的目的DNA處，點(diǎn)擊酶切后的目的DNA（槍頭內(nèi)顯示吸取10ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，點(diǎn)擊微量吸液器（出現(xiàn)槍頭內(nèi)液體注入EP管內(nèi)的畫面），液體注入后，EP管蓋子蓋上，微量吸液器回到原位置。

實(shí)驗(yàn)提示：加入酶切后的質(zhì)粒DNA

 

4、加入酶切后的質(zhì)粒DNA---- 1 點(diǎn)擊微量吸液器（說明框顯示“吸取5ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點(diǎn)擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“10ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點(diǎn)擊微量吸液器，拖動至盛有有粘性末端的載體DNA處，點(diǎn)擊酶切后的質(zhì)粒 DNA（槍頭內(nèi)顯示吸取5ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，點(diǎn)擊微量吸液器（出現(xiàn)槍頭內(nèi)液體注入EP管內(nèi)的畫面），液體注入后，EP管蓋子蓋上，微量吸液器回到原位置。

實(shí)驗(yàn)提示：加入10×DNA連接Buffer

 

5、加入10×DNA連接Buffer ---- 1 點(diǎn)擊微量吸液器（說明框顯示“吸取2ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點(diǎn)擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“10ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點(diǎn)擊微量吸液器，拖動至盛有10×DNA連接Buffer處，點(diǎn)擊10×DNA連接Buffer（槍頭內(nèi)顯示吸取2ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，點(diǎn)擊微量吸液器（出現(xiàn)槍頭內(nèi)液體注入EP管內(nèi)的畫面），液體注入后，EP管蓋子蓋上，微量吸液器回到原位置。

實(shí)驗(yàn)提示：加入DNA連接酶

 

6、加入DNA連接酶---- 1 點(diǎn)擊微量吸液器（說明框顯示“吸取0.25ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點(diǎn)擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“1ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點(diǎn)擊微量吸液器，拖動至盛有DNA連接酶處，點(diǎn)擊DNA連接酶（槍頭內(nèi)顯示吸取0.25ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，點(diǎn)擊微量吸液器（出現(xiàn)槍頭內(nèi)液體注入EP管內(nèi)的畫面），液體注入后，EP管蓋子蓋上，微量吸液器回到原位置。

     實(shí)驗(yàn)提示：加入ddH₂O

 

 7、加入ddH₂O ----點(diǎn)擊微量吸液器（說明框顯示“吸取2.75ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點(diǎn)擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“5ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點(diǎn)擊微量吸液器，拖動至ddH₂O處，點(diǎn)擊ddH₂O（槍頭內(nèi)顯示吸取2.75ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，EP管蓋子打開，點(diǎn)擊微量吸液器（出現(xiàn)槍頭內(nèi)液體注入EP管內(nèi)的畫面），液體注入后，EP管蓋子蓋上，微量吸液器槍頭自動至垃圾桶，微量吸液器回到原位置。

實(shí)驗(yàn)提示：振蕩器振蕩

 

8、振蕩---- 1點(diǎn)擊振蕩器，振蕩器出現(xiàn)在工作臺中央。②移動加完樣的EP管至振蕩器上方，③點(diǎn)擊“開始振蕩”，EP管開始在振蕩器上方旋轉(zhuǎn)振蕩，④點(diǎn)擊“停止”，即停止振蕩，振蕩器消失，EP管出現(xiàn)在工作臺中央。

    實(shí)驗(yàn)提示：恒溫槽連接

 

    9、恒溫槽連接---- 1點(diǎn)擊恒溫槽，恒溫槽出現(xiàn)在工作臺中央；②移動振蕩后的EP管至恒溫槽內(nèi)，③出現(xiàn)選擇恒溫槽溫度對話框，“1：4℃”，“2：16℃”，“3：42℃”，選擇“16℃”則提示“選擇正確”，對話框消失，如選擇其他則提示“選擇錯誤，請重新選擇”④點(diǎn)擊“開始連接”，則出現(xiàn)連接畫面，圖中顯示酶切后的目的DNA和酶切后的質(zhì)粒DNA逐漸靠近連接，連接在一起后提示：“DNA重組成功”。